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Tutorial_QIIME2_pt2.md

File metadata and controls

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Hola a tod@s!

En esta clase utilizaremos el programa gratuito QIIME 2 para analizar y visualizar análisis de diversidad de muestras microbiológicas (arqueas, bacterias y hongos) usando sequencias de ADN en formato fastq.

QIIME es un programa que está en constante actualización, así que podrían ocurrir modificaciones en los comandos aquí presentados, por lo queden estar atentos a las nuevas actualizacione y reportes de bichos (bugs!). Más información de QIIME en su website.

Continuamos con QIIME2

Generar un árbol para los análisis de diversidad filogenética

QIIME realiza varios análisis de diversidad genética, incluyendo la diversidad genética de Faith y las matrices UniFrac ponderadas y no-ponderadas. Este árbol se construye alineando todas nuestras secuencias, removiendo las posiciones altamente variables. Luego, QIIME usa FastTree para generar un árbol filogenético.

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree unrooted-tree.qza \
  --o-rooted-tree rooted-tree.qza

Artefactos resultantes:

aligned-rep-seqs.qza
masked-aligned-rep-seqs.qza
unrooted-tree.qza
rooted-tree.qza

Diversidad alfa y beta

QIIME calcula las métricas de diversidad alfa y beta de nuestras muestras, aplicando pruebas estadísticas asociadas y generando visualizaciones interactivas. Cómo elegir este valor no es fácil y debe estar basado en el número de secuencias que tiene cada muestra.

  1. Ahora vamos a calcular las métricas de diversidad alfa y beta con el comando core-metrics-phylogenetic, él cual a demás generará un análisis de coordenadas principales (PCoA).
Recuerden que el valor asignado a --p-sampling-depth va a depender caso a caso, y en nuestro caso elegiremos retener 900 secuencias (muestras son menos de 900 secuencias serán eliminadas para los siguientes pasos).
qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --i-table table.qza \
  --p-sampling-depth 900 \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --output-dir core-metrics-results

Artefactos resultantes

core-metrics-results/faith_pd_vector.qza

core-metrics-results/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

core-metrics-results/bray_curtis_pcoa_results.qza

core-metrics-results/shannon_vector.qza:

core-metrics-results/rarefied_table.qza

core-metrics-results/weighted_unifrac_distance_matrix.qza

core-metrics-results/jaccard_pcoa_results.qza

core-metrics-results/weighted_unifrac_pcoa_results.qza

core-metrics-results/observed_features_vector.qza

core-metrics-results/jaccard_distance_matrix.qza

core-metrics-results/evenness_vector.qza

core-metrics-results/bray_curtis_distance_matrix.qza

core-metrics-results/unweighted_unifrac_pcoa_results.qza

Visualizaciones resultantes:

core-metrics-results/unweighted_unifrac_emperor.qzv

core-metrics-results/jaccard_emperor.qzv

core-metrics-results/bray_curtis_emperor.qzv

core-metrics-results/weighted_unifrac_emperor.qzv
  1. Con esta información ya podemos explorar la diversidad microbiológica en nuestras muestras y compararlas entre sí. Qué vamos a comparar va a depender de nuestros metadata y qué métrica de diversidad vamos a analizar.

Ejemplo de metadata

Para este ejemplo vamos a analizar de la diversidad filogenética de Faith (una medida de la riqueza de la comunidad, pero tomando en cuenta las relaciones filogenéticas entre las secuencias).

qiime diversity alpha-group-significance \--i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv

Visualizaciones resultantes:

core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv Diversidad filogenética de Faith

Faith

  1. Ahora vamos a analizar la estructura comunitaria a través de un análisis llamado PERMANOVA (Anderson 2001), el cual usa la matriz de distancia entre cada una de las muestras para estimar la diferencias entre grupos.
qiime diversity beta-group-significance \
  --i-distance-matrix core-metrics-results/weighted_unifrac_distance_matrix.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --m-metadata-column transect-name \
  --o-visualization core-metrics-results/weighted-unifrac-transect-name-significance.qzv

Visualizaciones resultantes:

core-metrics-results/unweighted-unifrac-transect-name-significance.qzv Resultado del PERMANOVA

PERMANOVA

  1. Ahora vamos a gráficas las distancias entre muestras a través de un análisis de coordenadas principales (PCoA) usando EMPeror.
qiime emperor plot \
  --i-pcoa core-metrics-results/weighted_unifrac_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/weighted-unifrac-emperor.qzv

Visualizaciones resultantes:

core-metrics-results/weighted-unifrac-emperor.qzv Resultado del PCoA

Emperor

  1. Rarefacción alfa

Para saber la eficacia de nuestra secuenciación en términos de rescatar la diversidad de la comunidad microbiológica, necesitamos explorar la diversidad alfa en función de la profundidad de secuenciación.

qiime diversity alpha-rarefaction \
  --i-table table.qza \
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --p-max-depth 4300 \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization alpha-rarefaction.qzv

Visualizaciones resultantes:

alpha-rarefaction.qzv Gráfico de rarefacción

Rarefacción