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外周血单个核细胞的分离、冻存、复苏和培养（Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture）	2024-10-14	today	protocols cell

Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）包括T、B淋巴细胞（Lymphocyte）、NK细胞、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞

试剂和仪器

试剂

1. 1× Phosphate Buffered Saline (PBS) Sterile PBS 无菌PBS
2. Ficoll Histopaque
3. 二甲亚砜（DMSO）
4. 血清白蛋白（BSA）
5. 10%胎牛血清（FBS）
6. Freshly collected heparinised blood 新鲜采集的肝素化血液
7. Ficoll Histopaque (Sigma-Aldrich, catalog number: 10771; MP Biomedicals, catalog number: 091692254)： Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
8. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO

仪器

• Heparin vials (BD Biosciences, catalog number: 367886) 肝素小瓶
• Centrifuge - Sterile 15 ml centrifuge tube 无菌15ml离心管
• Pipette gun移液枪和1ml枪头

实验操作

1. 收集4 ml人静脉血于肝素化小瓶中，轻轻翻转试管数次，使其充分混合

2. PBS什么时候加等体积稀释血液

3. 移取4毫升Ficoll Histopaque到15ml离心管中

4. 使用1毫升移液枪将血液缓慢地沿管壁注入Ficoll Histopaque的顶部。血液和Ficoll Histopaque应该保持为两个不同的层。

5. Fixed angle rotors Centrifuge 时间min，转速×g，4℃，？升降

6. 立即（5min内）抽吸在组织水和培养基之间的界面中形成的白色棕褐色涂层（约1毫升）（PBMC）

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7. 用10 ml无菌PBS洗涤（在1 x g中离心时间分钟）两次。来自4ml血液的细胞的近似产率在$10^7$~$10^8$之间变化。

8. 细胞计数或培养：加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；

9. 细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮（-196℃）中长期保存。

1. Ficoll Histopaque和人类血液样本、PBS **?**之间的比例为*1:1:1。对于其它物种的PBMC的纯化比例可以是不同的。
2. Ficoll Histopaque储存在4°C温度下。使用前需要在室温下保持1-2小时，因为如果PBMC在预冷的Ficoll Histopaqueon血样中分层，PBMC会受到冷休克，有时会聚集