PlasmidDNA_purification_digestion_identification.qmd

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title: "Plasmid DNA purification,digestion and identification"
date: "2024-10-14"
date-modified: today
categories: [protocols, DNA]
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质粒DNA纯化、酶切与鉴定

## 试剂和仪器

### 试剂

1.  纯化
    -   Solution1 GET
    -   Solution2 NaOH，SDS 新鲜配制
    -   Solution3 高盐溶液 4℃保存
    -   TE 缓冲液
    -   LB 培养基 琼脂粉Agar
    -   含质粒的大肠杆菌DH5α
2.  酶切与鉴定
    -   EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ，通用缓冲液
    -   10× TBE缓冲液
    -   6×loading buffer
    -   菲啶溴红染色液： EB（溴化乙锭）
    -   Gel-Red荧光染剂 核酸染料
    -   DNA Marker

### 仪器

恒温箱，电泳仪，离心机，紫外灯，凝胶成像仪

## 实验操作

1.  培养细菌：将单菌落大肠杆菌接种在LB液体培养基，加入适当的**抗生素**，37℃培养12-18h

2.  **纯化质粒DNA**：分离细菌染色体、蛋白质、细菌胞膜、细菌核糖体

    1.  收集细菌：1.5ml EP管，离心，弃去上清液
    2.  去除RNA：GET 缓冲液，RNaseA，混匀，室温10min
    3.  溶菌：Solution Ⅱ，颠倒混匀至清亮，冰上5min，==避免震荡==
    4.  沉淀细菌染色体蛋白质：预冷Solution Ⅲ，颠倒混匀，冰上15min
    5.  获取粗提质粒：离心，上清液转移入另一个干净的EP 管
    6.  沉淀质粒：等体积异丙醇，颠倒混匀，室温5min，离心，弃去上清液
    7.  去除杂蛋白： $\ce{ ddH2O}$溶解沉淀，$\frac{1}{2}$体积$NH_4Ac$，颠倒混匀冰浴5min，离心，上清液转移入另一个干净的EP 管
    8.  沉淀质粒DNA：2倍体积无水乙醇，-20℃10min，离心，弃去上清液，吸水纸吸干
    9.  去除EP 管中的盐：70%乙醇，颠倒，离心，弃去上清液，吸水纸吸干
    10. 温箱干燥
    11. 保存待用：-20℃保存或30μL TE缓冲液或$ddH_2O$溶解

3.  酶切

    -   标准酶切反应体系（20μL）：
        -   单酶切：
            1.  质粒DNA X μL
            2.  配套的10 × 缓冲液 2μL
            3.  $ddH_2O$ 20-（X+3）
            4.  内切酶 2U（1μL）
        -   双酶切：
            1.  质粒DNA X μL
            2.  通用 10 × 缓冲液 2μL
            3.  $ddH_2O$ 20-（X+4）
            4.  内切酶1 2U（1μL）
            5.  内切酶2 2U（1μL）

    1.  20μL TE缓冲液或$ddH_2O$溶解质粒DNA，==浓度？==
    2.  EP 管编号，冰上进行，按上述依次加样，混匀
    3.  恒温37℃，酶解2\~3h
    4.  DNA电泳或-20℃保存

4.  电泳鉴定

    1.  琼脂糖凝胶
    2.  上样：6×loading buffer 含Gel-Red ==上样量？==
    3.  观察：254nm紫外灯 ，DNA红色荧光。305nm紫外灯，EB染色条带。