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RT-qPCR.md

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实时定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）
today
protocols
nucleic acid

聚合酶链式反应（逆转录+ ）荧光定量实时PCR

PCR 和 RT-PCR

**条件：**Primers、DNA、DNA Polymerase、Buffer、dNTP、dH2O  (具体比例参见实验Protocol)

**参数：**PCR循环数：通常为25-35次。不建议使用超过45个循环，循环数过多将导致非特异性条带产生。

Tm值：Tm=( 2℃ × number of A , T ) + ( 3℃ × number of G , C )

延伸时间：以实验室常用酶Taq酶为例，产物长度每1kb需要1min，可适当延长3-5 s。

引物设计

KEAP1**/STK11**

内参引物18s rRNA /β-Actin
18S(qPCR)-F GACTCAACACGGGAAACCTC
18S(qPCR)-R AGCATGCCAGAGTCTCGTTC

试剂、耗材和仪器

罗氏温度梯度荧光定量PCR仪：预约，电源开机，初始化，Ready，

  1. 热稳定DNA聚合酶（taq酶，-20℃）。
  2. 10×PCR扩增缓冲液。
  3. 25 mmol/L $MgCl_2$。
  4. 4种脱氧单核苷三磷酸（dNTPs）混合贮存液（20 mmol/L,pH=8.0,-20℃）
  5. 50×TAE缓冲液
  6. 阴性对照模板DNA
  7. 正向引物(F,20μmol/L)及反向引物(R,20μmol/L)溶于灭菌$ddH_2O$中
  8. EB（溴化乙锭）或荧光染料（Gel-Red）

{width="80%"}

  1. SYBR green I染料：在与dsDNA双螺旋小沟结合时，会在每个PCR循环结束时，绿色激发波长的光下激发染料发出荧光，非特异，
  2. Taqman引物探针类：使用与荧光团（报告基团，reporter，R）和猝灭剂分子（quencher，Q）相连的互补序列特异性寡核苷酸探针，持续暴露于适当波长的光下，并且猝灭剂分子在彼此靠近时吸收荧光团的荧光。DNA聚合酶在延伸过程中分离荧光团，防止淬灭

实验步骤与操作

  1. 目的细胞的培养

  2. （RNA的提取：Trizol法、硅吸附法，磁珠法）

  3. cDNA的制备

    1. 反转录体系
    2. 引物设计
    3. 半定量PCR反应体系
    4. RF PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM
    5. 核糖核酸酶RNase H降解原始mRNA，留下附着在cDNA上的primer
    6. 在DNA polymerase下合成互补链

  4. PCR 靶向扩增

    1. 引物设计（SYBR GREEN染料法）：20-24bp，纯度HPLC级别，无引物二聚体，退火60℃

    2. 引物配置

      1. 分子量计算公式：$$分子量 =C\times288+A\times312+G\times328+T\times303-61 $$或者==$$近似分子量\approx 碱基数\times 324.5$$==
      2. 引物工作浓度5-10 μmol/L,10 ×，20bp，2.0$OD_{260}$ $$1.0 OD_{260}=33\mu g Oligo DNA$$ 终浓度为50μmol/L
      3. 计算：$$分子量=20\times 324.5=6490 g/mol$$ $$质量数=2\times33=66\mu g$$ $$物质的量=66{\div}6490=0.010μmol$$ $$终体积=0.010{\div}50×10^6=200μL$$
      4. 离心机，$ddH_2O$溶解Oligo

    3. PCR反应组分：20μl，模板DNA，正向引物，反向引物，PCR缓冲液（含$MgCl_2$)，Taq酶，dNTPs混合液

    4. 实验设计

      1. 校准品（calibrator）：未经处理的细胞，正常组等
      2. 空白对照（No Template Control，NTC）：用水代替cDNA模板——排除自身污染
      3. RNA对照：排除自身残留基因组DNA污染
      4. 阳性对照（positive control，PC）：靶DNA片段，防止PCR反应抑制剂引起假阳性结果
      5. 阴性对照：P154 正向/反向引物，有/无模板DNA，非特异性配对，污染
      6. 生物学重复：不同的材料（时间、细胞株、批次、反应板）做的同一验证实验，至少3个
      7. 技术重复：同一材料的复孔，至少3个

    5. PCR仪 两步法/三步法

      +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 步骤 | 温度℃ | 时间 | 循环数 | 内容 | +======================+========+========+========+================+ | 1. 变性Denaturation | 94-95 | 5min | 1 | 预变性 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 1. 变性Denaturation | 94-95 | 10s | 30-45 | 循环中模板变性 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 2. 退火Annealing | 55~65 | 20s | 30-45 | 退火 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 3. 延伸Synthesis | 72℃ | 20-30s | 30-45 | 延伸 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | | | | | | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 1. 变性Denaturation | 94-95 | 5min | 1 | 预变性 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 1. 变性Denaturation | 94-95 | 10s | 30-45 | 循环中模板变性 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+ | 2. 退火/延伸 | 60-65 | 20s | 30-45 | 2. 退火/延伸 | +----------------------+--------+--------+--------+----------------+

    6. 产物鉴定

      1. DNA凝胶电泳
      2. EB染色

分子表现出的荧光被光电探测器检测，将荧光信号转换为可读格式。RFU

实时荧光定量RT-PCR需要配备检测器的专用PCR仪来实现实时定量$$Threshold\ Cycle(C_t)$$是每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的PCR循环数，远高于背景荧光 初始样品中目标RNA的量越大，荧光显著增加的速度就越快，从而导致较低的Ct.即$$C_t=\frac{1}{Target RNA}$$ $$ Ct=a×log \ mRNA + b $$

定量

简单相对定量——2^-Δ ΔCt^

假设扩增效率ET=ER=2

normalized relative ratio = 2^-Δ ΔCt^

ΔCt= Ct（target）- Ct（reference）描述了靶基因与内参基因Ct值的差值。

Δ ΔCt= ΔCt（sample）-ΔCt（calibratior）描述了感兴趣样品的平均ΔCt值与参考样品/校准样品的平均ΔCt值之间的差值。

适用于精确度要求不高的实验。

Target Gene reference gene Normalized Calibrated Fold Difference
Ave Ct Ave Ct ΔCt Δ ΔCt 2^-Δ ΔCt^
0 H 24.5 12.6 11.9 0 1
1 H 23.2 12.5 10.7 -1.2 2.3
2 H 25.4 11.6 13.8 +1.9 0.27

绝对定量——使用标准品进行绝对定量

$$ C_p=-k\lg X_0 + b $$

  • 横坐标：起始浓度的对数值，纵坐标：Cp值，

  • Efficiency=2（建议1.9-2.1），

  • R^2^ =1（建议>0.99），

  • Error=0（建议<0.2），

  • Slope=-3.3（建议-3.1~-3.6）

如何判断Ct值的有效性